Progetti in corso
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Protein Misfolding e Lipidi Cellulari: Analisi Quali-Quantitativa in Modelli di Infezione Naturale e Sperimentale di Scrapie. Effetto di Modulatori del Metabolismo/Traffico del Colesterolo.
Finanziato nell’ambito della Legge Regionale 7 agosto 2007, n. 7: “Promozione della ricerca scientifica e dell’innovazione tecnologica in Sardegna”
Tipologia progetto e area scientifica: Ricerca di Base – Scienze della Vita
Durata: 18 mesi
Finanziamento complessivo: € 154.000,00
Finanziamento Unità Operativa: € 61.000,00 (circa)
Ruolo: Coordinatore
Abstract
Formazione e deposizione di amiloide nel sistema nervoso centrale (SNC) è elemento distintivo delle patologie neurodegenerative conformazionali. Tra queste, le più studiate sono le malattie da prione (PD) e l’Alzheimer le quali, nonostante le proteine bersaglio siano diverse, ed oltre alle analogie nei meccanismi di formazione di fibrille e di tossicità neuronale che accomunano tutte le malattie conformazionali, condividono anche il sito di formazione di amiloide (domini lipidici raft delle membrane) ed alcune attività enzimatiche critiche (alfa- e beta-secretasi). Nel processamento amiloidogenico delle proteine bersaglio, i domini raft ricchi in colesterolo, piuttosto che semplici elementi strutturali, sembrano svolgere un ruolo funzionale. Dato che l’associazione di lipidi e colesterolo a costituire i domini raft è condizionato dal grado di interazione che i lipidi stessi possono stabilire con le molecole di colesterolo, formazione/traffico delle membrane, e di conseguenza segregazione/processamento delle proteine di membrana, sono regolati almeno in parte dal colesterolo. In vitro, la formazione della proteina PrPSc tipica delle PD, così come quella del peptide Abeta dell’Alzheimer, è di fatto influenzata da variazioni del contenuto cellulare di colesterolo. Recenti studi del gruppo di ricerca del Coordinatore in modelli di Scrapie naturale e sperimentale hanno messo in evidenza la presenza di uno sbilanciamento nei pool di colesterolo libero vs colesterolo estere a favore di quest’ultimo. Tuttavia, a dispetto della consistente letteratura che si và accumulando in questi anni sull’argomento, composizione, funzionalità e ruolo dei domini lipo-proteici di membrana in relazione ai processi amiloidogenici sono stati chiariti solo parzialmente. Le informazioni disponibili ad oggi provengono infatti o da studi condotti su sistemi di membrane artificiali o da indagini cell-based riguardanti solo alcuni dei vari componenti coinvolti (lipidi, oppure colesterolo, oppure proteine). Con il presente progetto intendiamo migliorare le attuali conoscenze analizzando comparativamente i cambiamenti dell’assetto metabolico di colesterolo, lipidi, e specifiche proteine durante il decorso della malattia da prione utilizzando a) encefali e fibroblasti dermici di ovini infettati per via naturale con la Scrapie, oppure sani con genotipi di proteina prionica associati a suscettibilità o resistenza all’infezione; e b) linee cellulari neuronali N2a, non-infette e infettate con prione-scrapie. L’obiettivo principale è quello di stabilire la dinamica delle modificazioni lipo-proteiche associate al processo di generazione di PrPSc, sia a livello centrale che periferico, e se esiste un’associazione tra un particolare profilo lipo-proteico cellulare (fenotipo) e la predisposizione delle cellule a favorire il processamento amiloidogenico della proteina prionica. La Scrapie degli ovini è stata scelta come modello di protein misfolding in quanto i) rappresenta il prototipo delle PD, ii) offre una serie di vantaggi dal punto di vista sperimentale permettendo di svolgere gli studi anche su cellule e tessuti ex vivo per la relativa facilità nel reperire in Sardegna ovini ammalati, ed infine iii) per la presenza in questo modello animale di soggetti geneticamente resistenti o suscettibili. L’approccio sperimentale prevede la valutazione comparativa nei diversi campioni, sia in termini qualitativi che quantitativi, di lipidi, colesterolo libero ed estere, e specifici enzimi e proteine, mediante metodi colorimetrici ed enzimatici, amplificazione genica (RT-PCR e real time PCR) ed immunoblotting (Western e dot blotting). L’impiego di farmaci capaci di modulare il metabolismo/traffico del colesterolo nelle colture cellulari ex vivo (i.e. fibroblasti ovini) e di linea (N2a) consentirà inoltre di studiare l’effetto di variazioni farmaco-indotte sulla composizione lipo-proteica dei diversi sistemi prione-cellula e, parallelamente, sulla formazione/accumulo di proteina prionica patogena (N2a).